活体荧光内窥镜（Fluorescenceinvivoendomicroscopy，FIVE）是一种先进的内窥镜技术，用于对细胞中的组织相互作用和分子事件进行成像。在本系列的第1部分中，讨论了共聚焦激光内窥镜（ConfocalLaserEndomicroscopy，CLE）的历史、类型以及该技术的局限性。在本系列的第2部分中，将介绍FIVE技术的几种应用，包括在癌症、胃肠道疾病和衰老方面的研究，同时也展望了该技术的发展前景。
01Fig.1用FIVE对猪的腹腔镜成像。（A）仪器设置。（B）回肠中微绒毛的组织结构。造影剂，静脉注射荧光素。（C）肝脏的微血管系统成像。造影剂，静脉注射荧光素。（D）肝包膜成像。造影剂，局部用0.5%吖啶黄素。（E）从膀胱浆膜表面成像的血管。（F）会阴部成像。造影剂，局部用0.5%吖啶黄素。比例尺=μm。
02Fig.2用FIVE在胃肠道中捕获的细胞细节。（A）用0.5％的吖啶黄染色的狗胃粘膜图像。（B）在胃绒毛周围的粘液中的犬幽门螺杆菌图像。图片经墨尔本大学兽医和农业科学学院的M.Sharman博士许可发布。03Fig.3静脉注射荧光素钠后，在对患者回肠末端的单个绒毛进行内镜检查期间实时捕获的序列图像。在1-2分钟的时间内观察到单个上皮细胞的脱落过程。（A）肠绒毛的上皮细胞开始形成单一的“缝隙”，并且在邻近的细胞周围有荧光素的聚集。（B）一个上皮细胞被“喷射”出来，留下一小缕荧光素，相邻的细胞开始“收缩”缝隙，首先从基底膜向腔侧恢复屏障功能。（C）相邻的细胞均匀排列。进一步缩小差距。（D）随着必要的细胞间连接巩固，屏障功能得到恢复。
04Fig.4（A）博莱霉素诱导的肺损伤模型中，用吖啶橙、0.05%蓖麻凝集素染色的肺结构图像。（B）肺部实质厚度增加（蓝色和白色箭头），以及巨噬细胞和化生上皮细胞“大细胞”染色（红色箭头）图像。图片经加拿大舍布鲁克大学OlivierLesur博士许可发布。
05Fig.5使用FIVE系统在术中对脑膜瘤、高级神经胶质瘤、垂体腺瘤和脉络丛乳头状瘤进行荧光素体外成像。图像显示了FIVE成像的神经定位，且图像与HE染色的组织活检图像相关。还显示了基于FIVE成像深度的后处理体积成像。经亚利桑那州凤凰城巴罗神经病学研究所许可使用。
06Fig.6采用FIVE系统对胶质母细胞瘤在术中的离体荧光成像，显示了成像的神经定位。FIVE图像显示了（A）恶性肿瘤块的侵袭性组织特征和（B）肿瘤内的不规则毛细血管（箭头）。经亚利桑那州凤凰城巴罗神经病学研究所许可使用。
07Fig.7实验性GL小鼠恶性神经胶质瘤的体内选择性抗体成像（GFP和FITC-EGFR荧光）。FIVE获得的图像与蔡司台式共焦系统获取的图像非常相似。图像可见肿瘤细胞浸润半岛（箭头所示），并与HE染色组织切片进行了比较。图像从肿瘤边界获得。（A）体内共聚焦内窥镜图像显示肿瘤细胞沿血管排列，且从主要肿瘤肿块中（箭头）伸出。（B）通过蔡司台式共焦系统获取肿瘤图像。（C）来自相同区域的HE切片（×20）显示了相似的组织学特征（箭头）。比例尺=μm。经亚利桑那州凤凰城巴罗神经病学研究所许可使用。08Fig.8采用FIVE荧光成像系统对猪脑表面血管进行成像。猪脑微血管功能状态的可视化成像。（A）动脉夹闭后（-μm直径）近端（夹住），观察到远端血流立即减慢。取下夹子后，注意到动脉血流模式恢复。通过对3只动物进行重复施夹和移除（1min），得到一致结果。（B）在所有动物手术结束时心脏骤停期间，都能观察到微血管腔内凝集和血栓形成的动态变化。（C）有些侧支功能不活跃，血流停滞（黄色短箭头指向毛细血管中的静息细胞；长长的白色箭头表示血流的方向）。（D）在手术创伤区域观察到血管收缩（白色短箭头）和部分血栓形成。这一系列的图像表明，血管的一部分有正常的流动（弯曲的黄色箭头），而血管的一部分有湍流（turbulentflow）（弯曲的白色箭头），只有少数凝集血细胞。（E）最上边的图显示了皮质损伤（冷损伤）区域中的皮质微脉管系统，由虚线勾勒出。在上边的第二个图像中，在动脉获得的Yellow荧光图像显示了荧光素渗入脑组织的总体外观。第二个图像中长方形圈出的区域的FIVE图像显示在下面。在底部图像中，FIVE显示小静脉内的腔内血栓形成和细胞对血管壁的粘附（白色箭头）。并且在冷损伤区域（3只动物重复）和开颅手术对皮层造成的意外手术损伤区域（在所有5只动物中均观察到）观察到一致的结果。（F）FIVE图像显示脊髓未受伤时（左图）和受伤时（右图）时的信息。脊髓中的正常微血管显示血管细长，带有分支和血脑屏障，可防止造影剂外渗。在脊髓损伤区域观察到多个血管外血细胞和造影剂外渗。经亚利桑那州凤凰城巴罗神经病学研究所许可使用。
09Fig.9使用吖啶黄素、PARPi-FL和匹配的HE组织病理学对乳腺癌乳房切除的样本进行体外成像。（A）正常脂肪和结缔组织的吖啶黄素染色图像。（B）未进行PARPi-FL染色的正常脂肪和结缔组织图像。（C）正常脂肪组织的HE染色。（D）吖啶黄素染色的肿瘤图像。（E）肿瘤的PARPi-FL染色图像。（F）肿瘤的HE染色图像。图片由PhillipCurrie博士提供。比例尺=μm。
Fig.10用nm蓝色激光扫描仪成像的斑马鱼眼的深度为μm的彩色编码的z堆栈图像。斑马鱼的血管内皮表达GFP，并且眼睛也被吖啶黄染色。
Fig.11识别和区分五幅图像有用区域的方法表明，即使是被有经验的评分员解释为“非诊断性”的图像，事实上也有一定的预测价值（A）。通常，图像中有用或无用的内容可能很微妙，然而，在对图像数据库进行计算系统训练之后，可以快速检测出模式。（B）进一步完善这一原理，以识别图像中的区域或“神经元”，这些区域或算法是使用深度卷积神经网络通过算法进行评估的，而深度卷积神经网络的信息最多，可能产生重要且快速的组织学信息。由于在术中图像过程中产生了大量图像（大约每秒1个），因此这种自动计算图像识别系统对于在临床共聚焦内窥镜成像中从无用图像中进行有用的分类将变得越来越重要。图像经亚利桑那州凤凰城巴罗神经病学研究所许可使用。
Fig.12小鼠回肠中微绒毛周围的粘液中的细菌图像。对比剂，局部应用0.5％的吖啶黄。
FIVE能够以惊人的形态细节探索生命系统。荧光团的发展提供了功能性和分子靶向成像功能，能够捕获无法在体外重建的特定细胞事件。这包括对以前从未见过的生理和病理过程以及体内细胞、亚细胞和分子事件的纵向研究。FIVE发现的意想不到的细节说明了它在理解系统生物学中可以发挥的重要作用，以及如何为其他仪器无法想象的重要问题提供答案。本文以题为“FluorescenceInVivoEndomicroscopyPart2:ApplicationsofHigh-Resolution,3-DimensionalConfocalLaserEndomicroscopy”于年5月发布在期刊MicroscopyToday上。论文链接: