具有独特的NF2突变的双相型透明样砂粒体肾细胞癌
ArganiP,etal.AmJSurgPathol.Jul.
概况
相较于其他癌种，肾细胞癌（RCCs）独特的形态与特定的基因变异相关。其中肿瘤细胞核仁明显，具有核周晕，与FH（富马酸水合酶）缺陷相关[1]，嗜酸性包涵体与SDH（琥珀酸脱氢酶）缺陷相关[2]，嗜酸性小体与TSC基因突变相关[3-5]，具有乳头样结构、胞质透明，可见砂粒体，这类亚型伴有染色体Xp11的易位/TFE3转录因子的基因融合[6,7]。
我们报道8例形态独特且尚未被报道的肾细胞癌，伴有NF2基因体细胞突变。由于先前有报道NF2与肾脏肿瘤相关，我们再次回顾了这些文献，以便找到我们的发现与先前的研究的联系。
结论
临床病史和组织学及影像学检测
表1和表2总结了这些病例的临床表现和病理特点。患者年龄51岁到78岁不等。6例男性，1例女性，性别不详者1名。病例2患者有终末期肾脏病接收肾移植手术21年，在自发性萎缩肾脏发现肿瘤。另外2例肾周有单纯性囊肿。另1例肿瘤患者有肾-肾上腺融合的病史。7例患者中5例行肾部分切除术，2例行根治性肾切除术。临床随访有限。但是，病例3出现骨转移，并在切除部分肾后发现肺转移。2个月后因病去世。
表01
病例的临床、病理及分子遗传特点.
表02
病例形态学特点
病理大体检查
肿瘤大小1-7cm。所有的肿瘤质实。其中记录6例病例的肿瘤切面颜色，5例为白色或褐色，另1例为色彩多样、橙色和粉色（图1）。质地坚实的4例，都被记录。除了病例3表现为远处转移及病例4侵犯肾周脂肪，确诊时所有肿瘤均局限于肾脏。
图01
BHC肾细胞癌病例3
肿物长4cm,呈白色纤维状外观，左侧为黄色肾周脂肪，右上方为正常肾组织。
病理组织学检查和免疫组化检测
所有的肿瘤都具有独特的形态学特点，因此将它们一起描述（图2-9）。所有肿瘤表现为圆形结节。取材部位在肿瘤与正常肾组织交接区域，7例中3例无包膜，3例部分有包膜，1例有完整包膜（图2A，3A，4A，5A，7A，8A，9A）。2例无包膜的肿瘤组织围绕正常肾小管（图9E）。
图02
BHP肾细胞癌病例1
肿瘤无完整包膜，与图中顶端的正常肾组织形成结节状边界（A）。典型的双向型，染色质固缩的小细胞聚集在透明样物质周围，染色质呈空泡状的大细胞形成小管和较大的腺泡（B）。小细胞形成远离基底膜的实性梭形细胞灶（C）。乳头上的小细胞与基底膜分支构成的腺泡，形成肾小球样结构（D-F）。透明样物质为IV型胶原，与基底膜样物质一致(G)。Ki-67免疫组化检测，肿瘤低增殖指数，特别是在较小的细胞中(H)。
图03
BHC肾细胞癌病例2
肿瘤与正常肾组织呈圆形结节状边界(a)。中倍镜下，肿瘤呈双相型，较大的上皮样细胞形成的大腺泡内，小细胞聚集在基底膜物质周围(B)。在较大腺泡内，小细胞分支聚集与基底膜物质相关，形成典型的肾小球样外观(C)图(D)。细胞角蛋白7优先标记形成大腺泡的大细胞(E)。EMA优先标记肾小球样体中的小细胞(F)。
图04
BHC肾细胞癌病例3
肿瘤无包裹;左上方为正常肾实质。肿瘤具有明显的双相型成分，大的上皮样透明细胞形成实体簇，小的细胞形成分支状乳头(a)。高倍镜下，可以看到染色质固缩的小细胞聚集在基底膜物质周围，大细胞染色质泡状，以及大量的砂粒钙化(B,C)。在其他区域，肿瘤有更多的纤维化间质，实性区域上皮样细胞围绕着小细胞，周围有玻璃样物质和砂粒钙化(D)。
图05
BHP肾细胞癌病例4
低倍镜下，右侧正常肾组织边缘可见肿瘤，无包膜(A)。中倍镜可见右侧为管状乳头状结构，左侧为实性管状结构(B)。管状乳头状结构显示，较大腺泡中较小的细胞聚集在基底膜物质周围，形成肾小球样结构(C),较实性的区域为硬化间质，其中有小管，更多的筛状结构聚集在基底膜物质周围，砂粒钙化(D)。
图06
BHP肾细胞癌病例5
大部分肿瘤表现为不可分类的肾细胞癌。低倍镜下，肿瘤呈透明状，右侧有明显的沙粒样钙化，左侧细胞清晰可见(A)。高倍镜下，透明细胞区域表现为难以区分的实性透明细胞增生，很难与高级别普通型肾透明细胞癌鉴别（B）。肿瘤的其他区域表现为黏液样间质中管状融合，联想到MTSC（两图右侧有砂粒钙化）（C,D）。其他区域，可见管状结构及双相型细胞（E）。这些区域的高倍视野可见较大的细胞，染色质开放，胞质嗜酸性，较小的细胞，染色质固缩，胞质嗜碱性（F）。
图07
BHP肾细胞癌病例6.
肿瘤与右侧正常肾组织交界处，未见包膜（A）。大多数肿瘤表现为双相型特点，大细胞构成腺泡，与腺泡内小细胞形成肾小球样结构（B）。硬化的间质内肿瘤上皮呈索状和管状，有助于与集合管癌的鉴别诊断（D）。典型的双相型区域（左下）与明显的胞质嗜酸性区域融合（右上）（E）。后者的肿瘤细胞胞质显著的嗜酸性，染色质空泡状、核仁明显，可见坏死（F）。
所有的肿瘤主要是实性型，尽管第7例中可见乳头状结构。其他病例只有实性型和管状结构（图8A）。
图08
BHP肾细胞癌病例7.
肿瘤与正常肾组织交界没有包膜。主要表现为伴有大量的砂粒钙化的实性管状病变（A）。肿瘤在其左缘与正常肾组织混杂（B）。高倍镜可见肿瘤细胞实性，巢状，染色质空泡状，核仁明显，胞质嗜酸性丰富，呈实性巢状，伴有砂粒样钙化（C,D）。
所有的肿瘤都具有典型的双相型表现，大的上皮样细胞染色质泡状，分化较好且胞质苍白淡染；小的上皮样细胞染色质凝集深染且胞质较少。所有的病例中，小细胞聚集在透明样结节周围，类似于成人颗粒细胞瘤的Call-Exner小体和典型的t(6；11)肾透明细胞癌的小细胞群[12-13]（图2B、C、3A、B、4B、C、7B、9C）。这种特点是7例的主要表现，在1例是局部表现。6例中，在大细胞构成扩张腺腔内，小细胞围绕嗜酸性物质类似毛细血管分支，形成与肾小球相似的特殊结构（图2D-F，3C，5C）。5例中，小细胞局部梭形样，并且形成远离透明样结节的实性区域（图2C）。所有8例病例包含砂粒体，富含2个。
虽然这些肿瘤大部分区域是实性和细胞性，至少局部可见玻璃变的硬化性间质。2例肿瘤上皮样成分被局限在致密间质中，呈条索状或梁状（图7D，9F）。2例局部具有透明细胞成分提示透明细胞肾细胞癌（图6B，9D），然而2例局部区域胞浆嗜酸性，核圆形，核仁明显（图7E，F，8C，8D）。1例具有与黏液管状梭形细胞肿瘤相似的局灶性分枝结构（图6C，D）。两个肿瘤可见坏死（图3D，7F）。核分裂像稀少，除病例1（2/10HPFs）和病例4（3/10HPFs），所有病例的核分裂像均小于1/10HPFs。
图09
BHP肾细胞癌病例8.
低倍镜下，肿瘤呈实性和乳头状结构，与右侧正常肾组织的交界处无包膜(a)。肿瘤呈双相型，右侧为实性、管状和乳头状区域，左侧为巢状透明细胞区域(B)。实性乳头状区域呈典型的双相形态，较小的细胞聚集在基底膜样物质，周围的细胞较大(C)。实性透明细胞区域难以与透明细胞肾细胞癌区分(D),肿瘤其他部位硬化的纤维间质,肿瘤细胞呈索状和管状肿瘤细胞侵犯正常的肾小球和肾小管(E)。在其他区域,肿瘤细胞增生的硬化纤维间质呈条索状(F)。
IHC结果没有特异性。免疫组化方面，所有的病例检测了PAX8（4/4），CK7（5/5），HNF1-beta（2/2）和EMA（2/2）。病例2，CK7标记大的上皮样细胞，而EMA标记小的上皮样细胞（图3E，F）。所有的病例中，GATA（0/7）、cathepsinK（0/7）、MelanA（0/4）、inhibin（0/6）、SF-1（0/6）和WT-1（0/6）是阴性。琥珀酸脱氢酶B亚基（2/2）和富马酸水合酶（3/3）是完整的。1例病例使用特殊染色标记4型胶原，与t（6；11）肾细胞癌基底膜样物质相符（图2G）。5例病例应用FISH检测TFE3和TFEB重排均为阴性[14,15]。1例为TFE3表达阴性，1例为TFE3和TFEB的FISH检测及免疫组化检测均为阴性[13,16]。
肿瘤提示Ki-67指数低。3例病例Ki-67指数5%（图2H），第3例中Ki-67指数约为5%，然而第1例（病例4，Ki-67指数最高）约为10%。值得注意的是，Ki-67指数在小的上皮样细胞中没有增加，在病例1和4中表现为低Ki-67指数。我们将标记的YAP1染色阳性为Hippo通路激活;然而，在正常肾组织中发现染色背景高，可能是由于未染色切片存放年限。然而，8例中有3例表现为细胞核和细胞质阳性;其中2例肿瘤组织的阳性强于周围正常的肾小管。4例肿瘤细胞质染色强度与周围正常肾小管相似，1例肿瘤细胞和周围的肾组织均未染色。
RNA测序与DNA突变分析
RNA测序，8例病例未检测出融合。
所有病例（8/8）存在NF2基因致病或可能致病变异（图10）。大部分变异是框移变异（3/8）或者截断（3/8）突变。其他NF2变异包括7个氨基酸的框内缺失（病例7）和剪切受体变异（病例4）。框内缺失发生在Merlin蛋白的高度保守的C-端区域，包括功能显著的丝氨酸残基，该残基的磷酸化调节Merlin的N端与C端结构域之间形成分子内相互作用[17]。剪切受体变异体（c.-1GA）是可能致病变异，此前有报道年轻的双侧前庭神经鞘瘤和脑膜瘤患者存在其的胚系变异[18]。
图10
BHP肾细胞癌复发的分子表现。
A.NF2基因的柱状图（ENST,NM_）显示已明确的变异分布。每个突变对应相应的病例编号绘制。坐标系上缺失-绿色；剪切受体变体-黑色；移码或无义突变-红色。B。病例2的拷贝数变异散点图显示染色体1p,6,16,20及22q拷贝数变异。
大多数的NF2突变被证实体细胞变异（病例1、3、4、6和8）。病例2和5，这两例没有与正常组织配对测序，并且等位基因频率与肿瘤纯度接近分别为73%和81%，出现框移或截断突变。
虽然没有复发性变异基因，但在许多情况下，复发性变异使得细胞通路发生异常，如DNA修复-ERCC5、FANCD2、MRE11A、POLQ、RAD50、RAD54L、WHSC1；染色质重塑-ARID1A、ARID2、AUTS2、CHD6、KMT2B、NCOA1、SMARCA4；细胞周期和分化-CHD6、CYLD、GLI1、PPP2R1B、PPP2R2B、RB1；细胞增殖、存活和凋亡-BCL2、MIB1、NPM1、SGK1、SMAD9。多发性广泛的染色体CNVs也存在。最常见的染色体变异包括20号染色体扩增（7/8）、6号染色体缺失（6/8）、1p染色体缺失（6/8）、22q染色体缺失（NF2的位置）。8例病例有4例为16号染色体扩增，然而8例中9q和19q缺失的病例有3例。
讨论
我们报道了8例特殊的且先前尚未描述的伴NF2体细胞突变的肾透明细胞癌病例。形态学特征具有双相型表现，大的及小的肿瘤细胞狙击在基底膜样物质周围，小细胞呈梭形，乳头状结构，类似肾小球，硬化性间质（可能形成质实白色的大体形态）和砂粒体。我们称为双相型透明样砂粒体肾细胞癌，简称为BHP肾细胞癌。
NF2基因编码Merlin蛋白，一种抑制多种受体依赖型肿瘤增殖信号通路的蛋白。Merlin蛋白介导细胞连接抑制细胞增殖。Merlin通过结合和干扰CD44功能阻断细胞生长，抑制Ras的致癌作用，抑制PI3K/AKT通路活性，负向调控和阻断mTORC1信号通路。后者可能为具有NF2失活肿瘤的潜在治疗靶点。NF2失活在多种肿瘤中都有报道[19,20]。2型神经纤维瘤病患者发生肾细胞癌的几率并不高，但是一种特殊的良性硬化性血管周病变与本研究病例并不相似[21-23]。8例伴NF2突变的肾细胞癌中，有5例表现为NF2所在的染色体22q的缺失，这与抑癌基因双等位基因失活相关。
我们推测，甲基化或杂合子拷贝中性缺失等我们的分析无法检测，这些第二等位基因失活的其他机制可能在其余病例中发挥作用。本文的队列研究中，我们无法证明NF2突变的功能效应。我们尝试通过IHC检测YAP1证明肿瘤的Hippo通路被激活。除了1例外，所有的病例都检测YAP1，我们还注意到在大多数病例中，这与正常的肾小管中YAP2表达相似，一次无法确定是否Hippo通路被激活。同样，所有的病例进行了NF2蛋白缺失的免疫组化检测，只有病例1检测到NF2蛋白缺失，但是正常的肾小管组织表达阴性，所以无法证明其NF2蛋白缺失。这两种蛋白难以通过免疫组化技术在FFPE组织检测到。然而，本研究未能证实NF2突变的功能后果，也缺乏其他相同的遗传变异以及NF2突变致病性或可能致病性的发现提示其可能是这种癌症的驱动基因。
在肾脏肿瘤中，NF2基因的作用机制尚不清楚。癌症基因组图谱（TCGA）测序研究表明，常见的肾细胞癌中NF2基因很少发生突变。TCGA报道大约1.7%的肾透明细胞癌（6/）存在NF2变异（无义突变1例、1例错义突变，4例剪切突变）（表3）。其中3例与肾透明细胞癌遗传完全一致，6例NF2变异的病例中有2例合并伴有VHL的错义突变（1例为LF，1例为DY），而第三例存在位于3p25的VHC深度染色体缺失[24]。回顾来源于TCGA数据库的三例伴有3p变异及NF2突变的肾透明细胞癌的线上图片（TCGA-CJ-,TCGA-CJ-和TCGA-B8-），表现为典型的肾透明细胞癌形态且不具有特殊形态。因此，我们认为NF2变异最能代表VHC缺失是继发性、晚期肿瘤驱动因素。根据这些研究，这些NF2突变的肾透明细胞癌明显差于NF2野生型的肾透明细胞癌（log-ranktestP=4.9e?5），表明肿瘤进展中NF2丢失具有重要的生物学作用。TCGA数据库报道3.2%的乳头状肾细胞癌存在NF2突变（9/）（表4）。然而，该数据库中9例乳头状肾细胞癌有2例(tcga-ev-和TCGA-SX-A7SL)可见双相型形态和与本文描述的肿瘤类似透明样结节，我们推测这2例可能代表BHP肾细胞癌。病例TCGAY8-A的形态学提示为BHP肾细胞癌。其他乳头状肾细胞癌不具有此特点[25]。近期的研究发现，NF2（22%）、PTPN14（31%）突变导致Hippo通路激活是MTSC的主要的异常驱动基因[26，27]。有趣的是本研究病例5有MTSC样区域。另一项研究发现29%的集合管癌病例中存在NF2突变，尽管这些病例尚未证实[28]。最终，NF2突变及Hippo通路的激活与肉瘤样肾细胞癌相关[29]。
表03
TCGA泛癌种数据库中伴NF2突变肾透明细胞癌
表04
TCGA泛癌种数据库中伴NF2突变乳头状肾细胞癌
我们推测肾脏肿瘤中NF2的作用与结节性硬化症基因变异TSC1/TSC2相似。首先，已发现的肾细胞癌亚型存在NF2和TSC1/TSC2基因失活可能是次要事件，例如上述提及伴有VHL基因失活的肾透明细胞癌。病例伴有NF2可能与临床病程进展相关。其次，TSC1/TSC2或NF2可能是罕见且具有独特形态的特殊肿瘤的主要驱动突变。TSC1/TSC2突变是嗜酸性实性囊性肾细胞癌（ESCRCC）关键的潜在的遗传变异[3-5]，TSC2或mTOR突变现在被描述为“嗜酸性空泡样肾细胞癌”或“高嗜酸性细胞性肿瘤”，形态学与ESC肾细胞癌存在重叠[30,31]。同样，NF2突变似乎是MTSC的遗传驱动因素，也可能是本文报道的BHC肾细胞癌的驱动因素，正如病例5所示，这可能存在形态重叠。第三，一些目前被认为未分类的高级别肾细胞癌病例是由NF2或TSC1/2变异驱动的。对其中一些病例的细致的检查可能会发现来自特殊低级别病变的线索，如ESC肾细胞癌或BHC肾细胞癌。例如，本研究的病例5和6的高级别胞质嗜酸性形态，以及病例5和8的透明细胞区域，使其最初被认为不可分类，因此这些肿瘤的独特特征仅在局部或不完全发育。按照这个思路，Chen等人[32]的一项重要的未分类肾细胞癌研究发现，高级别未分化肾细胞癌中，体细胞NF2突变占比为18%，mTOR/TSC/PTEN通路变异占比21%，并且NF2突变肾细胞癌在临床上更具侵袭性。虽然这些高级别肿瘤大多没有明显的且独特的形态，但是Chen和他的同事确实观察到伴NF2突变肿瘤呈结节样。
BHP肾细胞癌的鉴别诊断较为广泛，这反映在提交的会诊鉴别诊断中。这些已上传的病例的诊断报告中，大多数病例可见肾小球结构，提高对乳头状肾细胞癌的鉴别诊断。如上所述，TCGA队列中9例乳头状肾细胞癌存在NF2突变，所提供的图像有2例与本文报道的BHP肾细胞癌有明显重叠。我们推测NF突变型BHP肾细胞癌可能是罕见的具有2型乳头状肾细胞癌表型的病变，但其是遗传独特的亚型[33]。由于高级别乳头状特点是集合管癌的特征性表型，一些BHP肾细胞癌也可归类为一种亚型，这可能是报道中集合管癌的亚型存在NF2突变的原因[28]。双向型细胞学检查和经常出现的透明基底膜样结节提高了MiTF家族异位癌的鉴别诊断，特别是那些存在(6;11)(p21;q12)易位导致MALAT1-TFEB基因融合的肿瘤。虽然，MiTF家族易位肾细胞癌具有广泛的形态学谱系，但在这些病例中，cathepsinK阴性表达，TFE3/TFEB重排检测阴性，有助于排除该诊断。此外，在TCGA数据库中透明细胞和乳头状肾细胞癌存在TFE3或TFEB重排的14例肾细胞癌中，没有一例存在NF2基因突变(