来源：中华病理学杂志
作者：杨海玉刘勇（医院）
免疫组织化学是目前病理科应用最为广泛的常规检测技术，在肿瘤病理诊断、治疗及预后评估等方面发挥了重要作用。但是，作为一项检测技术，免疫组织化学必然有其使用局限性，主要包括一些指标缺乏特异性抗体、抗体灵敏度低或染色效果不佳导致结果不确定等。RNAscope是近年来发展的一项可用于检测完整细胞中目标RNA分子的原位杂交新技术。该技术主要包括组织预处理、探针杂交、信号扩增、图像观察分析等操作步骤，可同时检测多个靶分子以及分析不同类型细胞中基因表达信息与形态学分布的关系。由于独特的探针引物设计以及信号放大系统的改进，该技术的检测灵敏度和特异性与传统原位杂交技术相比有了极大的提高。尤其重要的是，RNAscope技术适用于甲醛固定、石蜡包埋组织或冷冻组织切片中RNA分子的检测，同时具备了显色和荧光检测系统，其结果可直接用明场或荧光显微镜观察。作为免疫组织化学的有效补充方法，上述优点使得RNAscope技术应用于临床病理工作成为可能。我们就RNAscope技术的原理与特点及其在肿瘤病理学中的应用进展做一综述。
一、RNAscope技术原理与特点
RNAscope是一种新型的超敏RNA原位杂交检测技术，具有独特的特异性探针设计和信号放大系统，能极度降低背景噪音，其主要操作步骤包括：(1)组织切片预处理，以增加其通透性；(2)目的RNA与特异性探针杂交；(3)信号放大系统与探针杂交；(4)在明场或荧光显微镜下观察结果。RNAscope主要技术原理是利用双"Z"探针引物与目标RNA序列互补结合，以实现特异性信号放大。Z型探针底端是一段长约18～25个碱基的序列，能够互补结合到目标RNA上；探针顶端是一段14个碱基长度的序列，两个探针引物的顶端序列共同构成一段28个碱基长度的结合区，可与信号放大前体序列结合。值得注意的是，单一探针与非目标序列的结合并不能提供足够长度的信号放大前体序列结合区，因而阻断了非特异性信号的出现。研究证实3对Z形探针引物足以实现对单一RNA分子的检测。对于任意一个目标RNA序列来说，都有一组独特设计的20对Z形探针引物，在部分序列不能有效暴露或部分RNA降解的情况下，这些探针足以保障目标RNA分子的检测。RNAscope技术不仅具有特异性强、灵敏度高、信噪比高等优点，而且可同时观察和定量单个细胞中多重mRNA分子的表达水平，并实现自动化及高通量分析。另外，有学者将RNAscope和免疫组织化学结合应用于同一张组织切片的标志物检测，该方法的成功取决于实验条件的摸索，尤其是抗原修复和蛋白酶消化时间的选择。RNAscope技术使得RNA分子标志物在组织形态结构中可视化，其染色阳性信号呈点状分布，并且能进一步定量分析，对于检测新的尚无可用抗体的生物学标志物以及非编码RNA具有一定的应用价值。
二、RNAscope在肿瘤病理学中的应用
1．肿瘤治疗反应评价：
目前针对程序性细胞死亡配体－1(PD－L1)及其受体PD－1的免疫靶向治疗为肿瘤患者带来希望，其主要作用机制是阻断PD－1/PD－L1结合。根据PD－L1表达水平可判断患者对这一新型肿瘤免疫治疗的反应，目前针对PD－L1的检测方法主要是免疫组织化学。有学者采用4个不同克隆号的抗体及RNAscope技术检测非小细胞肺癌中PD－L1的表达，证实仅1个克隆号抗体和RNAscope能有效证实其特异性表达，且PD－L1蛋白和mRNA阳性表达均提示预后较好。由此可见，并非所有商品化PD－L1抗体具有特异性，而RNAscope是一种可行的替代检测方法。有学者采用RNAscope技术检测了例原发性乳腺癌中PD－L1mRNA的表达，证实其阳性率为55.7%～59.5%。另一学者分析了例1～3级脑膜瘤，结果证实3级肿瘤中CD4＋、CD8＋T淋巴细胞和PD－1阳性的细胞数量明显减少，而肿瘤细胞中PD－L1蛋白和mRNA表达水平均明显增高。以上研究认为，RNAscope是一种有前景的应用于临床检测肿瘤组织中PD－L1表达的技术方法。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种针对HER2基因的分子靶向药物，临床证实其对于HER2过表达的转移性乳腺癌及胃癌患者有较好疗效。在临床病理工作中，准确判断肿瘤组织中HER2基因状态，对于评价患者接受曲妥珠单抗治疗的疗效具有非常重要的意义。目前公认的HER2检测方法包括免疫组织化学和荧光原位杂交(FISH)，前者针对其蛋白表达，后者则是针对DNA扩增进行检测。然而，目前临床上仍有一些病例因免疫组织化学染色不佳或存在肿瘤内异质性等问题而导致检测结果不确定。有学者检测了例浸润性乳腺癌中HER2mRNA的表达，证实RNAscope与FISH的检测结果一致性达到97.3%。另一学者采用RNAscope技术检测例胃癌组织中HER2mRNA的表达，同样证实HER2mRNA表达与蛋白及DNA扩增检测结果有较好的一致性。国内有学者分析了HER2免疫组织化学结果不确定的乳腺癌原位mRNA表达特征，认为根据原位mRNA表达结果，可将免疫组织化学HER2(2＋)的乳腺癌病例进一步分类，其中以RNAscope评分4分作为HER2mRNA高表达的判读标准。综上所述，RNAscope技术可作为临床验证免疫组织化学检测结果及反映HER2基因状态的有效补充。另外，有学者采用RNAscope技术检测了乳腺癌中雌激素受体(ER)mRNA的表达，证实ERmRNA高表达患者对他莫昔芬治疗有效。目前针对γ－分泌酶nicastrin研制了一种可阻断相关癌基因信号通路的治疗单抗，研究证实RNAscope可用于检测乳腺癌组织中nicastrin基因表达，并以此作为判断患者抗nicastrin治疗反应的指标。因此认为，RNAscope可作为检测肿瘤组织中生物学标志物的候选技术方法，具有潜在的临床应用价值。
2．肿瘤组织人乳头状瘤病毒(HPV)检测：
研究证实高危型HPV感染是发生于口咽、头颈部及宫颈鳞状细胞癌的重要致病因素。评估高危型HPV持续感染，不仅需要识别HPV基因类型，同时也需要检测HPV病毒载量以及病毒基因组在宿主染色体的整合状态。目前，临床上检测HPV的主要方法包括HPVDNA检测及p16免疫组织化学检测。但是，这些方法均有一定的使用限制，其中p16蛋白过表达是HPV感染的间接指标，而HPVDNA检测并不能反映病毒转录状态。HPVE6和E7癌基因的表达是维持病毒持续感染的关键，而对其mRNA的检测可评估病毒持续感染后的整合状态。最新研究证实RNAscope技术可用于检测中性甲醛固定、石蜡包埋组织中高危型HPVE6/E7mRNA表达，为评价肿瘤组织中HPV是否存在及其活化转录状态提供直接证据。有学者比较了头颈部鳞状细胞癌中RNAscope检测高危型HPVE6/E7mRNA和免疫组织化学检测p16蛋白的敏感性、特异性及阳性率，分别为93%、94%、96%和96%、93%、96%，两种检测方法的结果基本一致。另一学者采用RNAscope检测了79例口咽部鳞状细胞癌中高危型HPVE6/E7mRNA的表达，证实其检测灵敏度和特异性分别达到97%和93%。由此可见，RNAscope可作为肿瘤组织HPV常规病理检测的技术方法之一。宫颈上皮内瘤变(CIN)包括CIN1～3，目前又分为低级别和高级别病变。有学者检测了86例CIN病变中高危型HPVE6/E7mRNA表达，证实其在CIN2和CIN3病例中阳性率均达到%。有趣的是，研究者发现在不同级别的CIN病变中，HPVE6/E7mRNA染色模式各不相同。CIN1表现为表皮上层弥漫性核染色，CIN2表现为浅表层弥漫核染色和表皮全层多个细胞核及细胞质内点状信号，而CIN3则以多个点状信号为主，极少见到弥漫性核染色。这些染色模式的不同充分证实CIN1为HPV感染增殖期，CIN3为HPV转化期，CIN2则介于两者之间。由此可见，HPVE6/E7mRNA检测具有高度敏感性和可区分染色模式的优势，使得RNAscope技术可作为CIN分级的备选方法之一，尤其是针对低级别和高级别评价有争议的病例。另外，一些研究证实非小细胞肺癌中也存在HPV感染证据，但其意义尚不明确。有学者检测了例肺癌患者中HPV状况(包括例肺腺癌和96例肺鳞癌)，证实有19例肺腺癌和9例肺鳞癌表现p16阳性，但所有病例经DNA和RNA原位杂交检测呈HPV阴性。该研究并未获得非小细胞肺癌与HPV感染相关的直接证据，由此可见p16阳性并不能作为证实HPV感染与肿瘤发生相关的充分依据。
3．肿瘤诊断与鉴别诊断：
检测免疫球蛋白轻链限制性是证实B细胞克隆性增生的方法之一，对于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B－NHL)的诊断及鉴别诊断具有重要意义。目前国内多采用免疫组织化学检测免疫球蛋白轻链限制性，由于部分B细胞分化较低、抗体本身的局限性以及组织固定不良或石蜡切片所致抗原丢失等因素，导致部分结果无法判断。研究证实应用RNAscope技术在常规石蜡切片上检测轻链κ/λ的mRNA表达，阳性细胞定位准确、背景清晰，轻链限制性结果判断可靠而灵敏。有学者采用RNAscope技术检测κ/λmRNA在皮肤淋巴瘤中的表达，证实有15例表现B细胞克隆性，该结果与RT－PCR检测一致性达到96.1%。也有学者采用RNAscope和流式细胞术检测B－NHL中轻链限制性，证实两种方法的检测结果具有高度一致性(99%)，认为RNAscope原位杂交是评价轻链限制性的可选择方法之一。甲状腺转录因子(TTF)1和NapsinA是鉴别肺腺癌和肺鳞癌的关键标志物，同时可帮助鉴定不明来源的肿瘤起源。有学者检测了80例肺腺癌和肺鳞癌中TTF1和NapsinA的表达，证实肺腺癌中TTF1及NapsinAmRNA的阳性率分别为92.5%和90.0%，而免疫组织化学检测蛋白阳性率仅为82.5%和77.5%。Lgr5被证实是胃肠道肿瘤干细胞的有效标志物，RNAscope技术可用于标记胃窦部基底腺中的Lgr5(＋)细胞。研究证实与正常胃黏膜组织相比，Lgr5(＋)细胞在胃肿瘤中数量较多，并且主要集中于肿瘤腺体基底部，认为可能与胃癌早期发生相关。另外，有学者比较了食管鳞状细胞癌与正常食管上皮细胞的基因表达谱，并采用RNAscope技术进一步验证低表达水平的差异基因(CD44和EpCAM)，提示两者均与食管鳞状细胞癌发生相关。由此可见，RNAscope技术可为筛选肿瘤诊断与鉴别诊断候选标志物提供重要的方法学支持。
4．肿瘤预后评估：
PTEN是公认的肿瘤预后标志物。然而，目前针对PTEN的免疫组织化学染色尚未做到标准化。有学者研究证实在混合性肿瘤组织芯片中，RNAscope检测PTENmRNA的灵敏度明显高于免疫组织化学检测PTEN蛋白(56%/42%)。该研究认为，采用RNA原位杂交的方法评价PTENmRNA表达水平，可为临床提供一种结果可重复性的验证方法。另外，研究发现RNAscope技术可用于评价肿瘤标志物表达模式与预后的关系。研究证实PROX1作为癌基因涉及各种肿瘤的发生发展过程，免疫组织化学证实其主要表现为细胞核染色模式；然而，也有研究发现少数肿瘤表现为特殊的细胞质染色模式。有学者采用免疫组织化学和RNAscope技术检测PROX1在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达方式，两种方法均证实PROX1可在肿瘤细胞质中表达，因而认为PROX1胞质染色是一种真实的表达模式。有趣的是，该研究还证实PROX1mRNA高表达与淋巴结转移相关，提示PROX1是一种潜在的肿瘤预后标志物。另研究证实趋化因子CXCL14在某些肿瘤间质中高表达，例如前列腺癌和乳腺癌，但其预后意义不明确。
目前，免疫组织化学和DNA原位杂交方法广泛应用于临床检测肿瘤蛋白和DNA标志物，但是关于RNA的原位分析较为少见，其主要原因是受限于技术的复杂性及其检测灵敏度和特异性不足以满足临床需求。RNAscope是一种新的RNA原位杂交技术，其独特的Z型探针设计和放大信号系统，可用于单分子RNA检测并保持完整的标本组织结构。研究证实RNAscope技术具有优异的灵敏度和特异性，不仅可通过显色法或荧光法精确检测目标RNA分子，而且能进一步分析肿瘤标志物的异质性染色模式与预后的相关性。RNAscope技术能够在缺少有效抗体或者抗体灵敏度/特异性不能满足临床需求的情况下，为免疫组织化学检测提供有效的补充。另外，RNAscope技术还能有效检测到分泌蛋白的RNA以及非编码RNA，而后者并不能通过现有的免疫组织化学方法实现。由此可见，RNAscope原位杂交技术是一种具有前景的分子病理诊断方法。